在生物醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展的當(dāng)下，多能干細(xì)胞的研究為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了前所未有的曙光。其中，來自多能干細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞藥物，正逐漸從實(shí)驗(yàn)室的理論設(shè)想邁向臨床應(yīng)用的現(xiàn)實(shí)。這一創(chuàng)新療法不僅有望重塑神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療格局，更可能為無數(shù)患者帶來新的希望。本文將深入探討這類神經(jīng)細(xì)胞藥物從研發(fā)構(gòu)思到臨床前評估的每一步歷程，剖析其背后復(fù)雜而精妙的科學(xué)進(jìn)程。

1.有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的介紹

神經(jīng)系統(tǒng)是人類各種認(rèn)知和運(yùn)動功能的控制中心，神經(jīng)系統(tǒng)紊亂會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來，神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為全球死亡和殘疾的一個重要原因，例如神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷，2016年分別影響了900萬人和2.76億人。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(?CNS?)的自我修復(fù)能力有限，針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治愈方法仍然很少。

長期以來，細(xì)胞替代療法一直是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種非常有前景的方法。胎兒腦源性神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC) 和腹側(cè)中腦 (VM) 組織分別在治療中風(fēng)和帕金森病 (PD)?方面表現(xiàn)出積極作用。然而，由于倫理限制和細(xì)胞質(zhì)量的變化，胎兒組織的應(yīng)用往往受到限制。人類多能干細(xì)胞 (hPSC)，包括人類胚胎干細(xì)胞 (hESC) 和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC)，由于其無限的自我更新能力和向所需外胚層細(xì)胞類型的多分化潛力，為移植提供了可行的神經(jīng)元細(xì)胞來源。到目前為止，幾種 hPSC 衍生的神經(jīng)元細(xì)胞類型已在神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中成功測試，并已證明其體內(nèi)安全性和有效性。一些國家還啟動了首次人體臨床研究。

不過，細(xì)胞衍生物制備和質(zhì)量評估挑戰(zhàn)重重，涉及細(xì)胞類型選擇、分化階段確定、動物模型構(gòu)建、質(zhì)量控制等多方面，這嚴(yán)重阻礙了干細(xì)胞臨床應(yīng)用和商業(yè)化。

鑒于各國要求不同，監(jiān)管政策有差異。國際干細(xì)胞銀行計(jì)劃匯聚研究人員，發(fā)表系列文件，就多能干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化達(dá)成全球共識，涵蓋質(zhì)量控制、倫理等方面，推動了轉(zhuǎn)化并保障細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量安全，還與其他組織合作推進(jìn)細(xì)胞藥物制造標(biāo)準(zhǔn)化。

將多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞藥物要經(jīng)過開發(fā)、生產(chǎn)和臨床前評估三大工序

在干細(xì)胞治療帕金森病領(lǐng)域，GForce-PD發(fā)揮國際協(xié)調(diào)作用。本文總結(jié)干細(xì)胞治療臨床前研究原則，為學(xué)術(shù)產(chǎn)品開發(fā)者提供指導(dǎo)，實(shí)際應(yīng)用需遵循當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)^[1]。

2.早期原則和產(chǎn)品開發(fā)

2.1 細(xì)胞獲取的倫理原則

• hESC和hiPSC依賴人類捐獻(xiàn)者，獲取捐獻(xiàn)者細(xì)胞需遵循國際公認(rèn)原則（如ISSCR 2016指南）與當(dāng)?shù)胤煞ㄒ?guī)。
• 每個細(xì)胞系必須有捐獻(xiàn)者 / 主治醫(yī)生簽署的知情同意書，以及醫(yī)院的倫理支持文件。
• 要告知捐獻(xiàn)者隱私保護(hù)的限制，以滿足安全性和可追溯性需求。

2.2 細(xì)胞供體的選擇

• 需對胚胎或細(xì)胞捐獻(xiàn)者進(jìn)行仔細(xì)風(fēng)險評估，篩查各類潛在人類傳染性病原體，如 HIV、HBV、HCV 等嚴(yán)重血源性病毒性疾病。
• 根據(jù)捐獻(xiàn)者選擇過程中的信息，考慮篩查其他生物體。
• 專業(yè)評估還應(yīng)考量遺傳病。
• 建議收集捐獻(xiàn)者血液樣本的ABO血型、HLAI類和 II 類基因型信息，用于檢查衍生細(xì)胞系身份，以及匹配細(xì)胞系血液和組織類型，降低患者免疫反應(yīng)。

2.3 適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)細(xì)胞類型

• 合適的細(xì)胞分化條件決定神經(jīng)元細(xì)胞多樣性，不同細(xì)胞表型特性和功能各異。
• 帕金森病由黑質(zhì)中腦多巴胺能神經(jīng)元（mDA）丟失引發(fā)，只有mDA細(xì)胞能在帕金森病模型中建立正確連接，獲得治療效果，前腦/后腦神經(jīng)元無效。
• 肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）特征為上下運(yùn)動神經(jīng)元丟失，由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性引起，除移植運(yùn)動神經(jīng)元，移植健康星形膠質(zhì)細(xì)胞改善微環(huán)境也是有效治療方法。
• 腦損傷、中風(fēng)和脊髓損傷等涉及多種神經(jīng)細(xì)胞功能喪失和微環(huán)境變化，使用單一神經(jīng)元細(xì)胞恢復(fù)連接有挑戰(zhàn)，神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）能分化成神經(jīng)元且分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，是有前途的治療細(xì)胞類型。

2.4 移植細(xì)胞的階段

• 基于 hPSC 的神經(jīng)替代療法，移植階段的選擇很關(guān)鍵。
• 早期神經(jīng)祖細(xì)胞存活神經(jīng)元產(chǎn)量高，但有不受控制增殖風(fēng)險；成熟神經(jīng)元移植后存活率差。
• 移植細(xì)胞的存活情況和動物模型行為改善可提示適當(dāng)?shù)囊浦搽A段。需找出不同階段（增殖祖細(xì)胞、有絲分裂后神經(jīng)母細(xì)胞、成熟神經(jīng)元）的特定標(biāo)志物。
• 帕金森病細(xì)胞治療研究中，早期有絲分裂后神經(jīng)元應(yīng)用最廣泛；星形膠質(zhì)細(xì)胞移植中，譜系限制性祖細(xì)胞應(yīng)用廣泛，但各制造階段最佳細(xì)胞表型仍待進(jìn)一步研究。

3.細(xì)胞制造質(zhì)量控制的一般考慮因素

3.1 質(zhì)量管理體系

• 完善的質(zhì)量管理體系（QMS）對確保細(xì)胞庫運(yùn)營和細(xì)胞生產(chǎn)的可靠輸出極為關(guān)鍵，建議遵循適用于許可產(chǎn)品的良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）。
• QMS 需針對制造產(chǎn)品，明確制造商責(zé)任、采用標(biāo)準(zhǔn)及所有制造程序摘要，涵蓋捐贈者樣本收集、原材料選擇等一系列操作程序與質(zhì)量文件。
• QMS 要保證從原材料到最終產(chǎn)品的所有材料和程序具有可追溯性，通常在質(zhì)量手冊中闡述一般程序、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和政策。

3.2 細(xì)胞株存庫流程

• 制備臨床細(xì)胞產(chǎn)品的首要步驟是確保建立 hPSC 的供體適用性，保存生產(chǎn)細(xì)胞的早期庫存，選擇符合 GMP 標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)質(zhì)量控制和安全測試線。
• 依據(jù)適用標(biāo)準(zhǔn)選擇和鑒定試劑及材料，如 “無異種” 和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基等。
• 為減少不同批次細(xì)胞差異，建議采用包含主細(xì)胞庫（MCB）和工作細(xì)胞庫（WCB）的多級細(xì)胞庫系統(tǒng)作為生產(chǎn)培養(yǎng)物供應(yīng)起點(diǎn)。

3.3 hPSC 的質(zhì)量控制

• hPSC 作為起始材料，其質(zhì)量對確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和可重復(fù)性意義重大。
• 需對細(xì)胞庫材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制檢測，包括細(xì)胞形態(tài)、活力、DNA 指紋等多項(xiàng)測試。
• hPSC 的批次間差異可能是工藝差異的主要來源，因此需開發(fā)大量同一批次的 hPSC 。

3.4 產(chǎn)品過程管理

• 整個生產(chǎn)過程中，必須嚴(yán)格把控細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量。質(zhì)量管理體系應(yīng)在關(guān)鍵步驟指明特定的質(zhì)量控制測試，如細(xì)胞標(biāo)志物和微生物測試，以保證提供具有特定傳代水平的可重復(fù)細(xì)胞制劑。
• hPSC 衍生產(chǎn)品的生產(chǎn)過程主要包括 hPSC 生產(chǎn)和神經(jīng)元細(xì)胞生產(chǎn)兩部分。hPSC 生產(chǎn)中，擴(kuò)增時要進(jìn)行過程測試以確保其保持內(nèi)在特性；神經(jīng)元細(xì)胞生產(chǎn)中，在分化過程的不同時間點(diǎn)進(jìn)行多項(xiàng)質(zhì)量控制測試，文中圖1總結(jié)了當(dāng)前通用的已發(fā)布工作流程。

3.5 移植細(xì)胞的純度

• hPSC 神經(jīng)替代療法的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是獲取高同質(zhì)性目標(biāo)細(xì)胞類型。需明確最終細(xì)胞產(chǎn)品全部組成并清除殘留干細(xì)胞，因其有安全風(fēng)險。
• 臨床證據(jù)顯示，污染的5-羥色胺神經(jīng)元可致PD患者移植物誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙，臨床前研究表明殘留祖細(xì)胞會在腦或脊髓中異常增殖或形成結(jié)構(gòu)。
• 部分研究團(tuán)隊(duì)采用特定表面標(biāo)志分選細(xì)胞、添加槲皮素等策略提高純度，且需驗(yàn)證無未分化細(xì)胞。

3.6 細(xì)胞配制和保存

• 細(xì)胞作為“活藥物”，其生物過程持續(xù)進(jìn)行且受環(huán)境影響，建立有效保存制度很關(guān)鍵。
• 細(xì)胞制劑分新鮮非冷凍和冷凍保存兩類。新鮮細(xì)胞活力和特性好但壽命短，不適合長期儲存和全面質(zhì)控；冷凍細(xì)胞保質(zhì)期長，可進(jìn)行質(zhì)控和安全放行測試，但凍融有損傷等問題。
• 應(yīng)選擇適合神經(jīng)元細(xì)胞的冷凍保存液，并驗(yàn)證冷卻、解凍條件，且解凍后24小時細(xì)胞活力和恢復(fù)情況可準(zhǔn)確反映冷凍效果，同時要按 ICH Q5C 指南研究細(xì)胞產(chǎn)品儲存和運(yùn)輸穩(wěn)定性。

3.7 細(xì)胞產(chǎn)品放行測試

• 細(xì)胞產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性是體內(nèi)安全有效的前提，需對產(chǎn)品批次按預(yù)定比例測試。
• 評估系統(tǒng)包括生物污染、細(xì)胞活力等體外測試，應(yīng)基于多批次數(shù)據(jù)制定放行測試公差。
• 基因組完整性檢測（如全基因組測序）有助于了解遺傳變異風(fēng)險，但要明確基因變化與患者安全相關(guān)性，雖無統(tǒng)一基因組穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)，可參考已發(fā)表研究，選擇無癌癥相關(guān)基因大異常或非同義突變細(xì)胞有助于降低致瘤風(fēng)險，但不能完全認(rèn)證體內(nèi)安全性。

4. 臨床前體內(nèi)評估

4.1 細(xì)胞移植的部位

• 神經(jīng)元細(xì)胞移植旨在組織替代或提供局部營養(yǎng)，需將細(xì)胞遞送至目標(biāo)部位。例如中風(fēng)時在缺血半暗帶移植以拯救細(xì)胞和重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；ALS 最佳途徑是鞘內(nèi)注射；PD 治療可將細(xì)胞移植到背側(cè)紋狀體或黑質(zhì)。
• 嚙齒動物一到兩個部位移植可實(shí)現(xiàn)神經(jīng)支配，靈長類動物大腦較大，為實(shí)現(xiàn)足夠神經(jīng)支配，PD 臨床研究中每個半球常需三到八個注射道，非人靈長類動物在移植策略評估上因大腦與人類相似具有優(yōu)勢，小動物移植策略不足以模擬人類治療。

4.2 毒性試驗(yàn)及劑量耐受性

• 界定細(xì)胞毒性和劑量耐受性對新藥至關(guān)重要。毒性測試應(yīng)遵循臨床途徑，研究對靶器官及肝臟、心臟、腎臟等非靶器官的毒性作用。
• 高劑量細(xì)胞給藥安全風(fēng)險更大，動物實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不同劑量組確定最大可行劑量可為臨床研究提供支持，當(dāng)細(xì)胞在體內(nèi)可能增殖時，劑量確定更具挑戰(zhàn)性，大鼠或小鼠腦內(nèi)和脊髓接受細(xì)胞數(shù)量有一定范圍。

4.3 過度生長和致瘤性檢測

• hPSC 衍生細(xì)胞安全性需考慮不受控制的增殖和腫瘤形成。過度細(xì)胞生長會影響宿主細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和功能，要通過對足夠數(shù)量動物進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析研究移植物體積和增殖標(biāo)志物，移植物體積與移植細(xì)胞性質(zhì)有關(guān)，如較年輕或分化程度低的細(xì)胞擴(kuò)增更廣泛，純化神經(jīng)元制劑細(xì)胞損失和移植物尺寸減小。
• 要區(qū)分致癌性（宿主正常細(xì)胞受刺激形成腫瘤）和致瘤性（與移植細(xì)胞有關(guān)），為確定未分化 hPSC 污染情況，一些研究小組進(jìn)行加標(biāo)研究。

4.4 體內(nèi)存活和分布

• 神經(jīng)細(xì)胞移植期望在宿主體內(nèi)長期存活以替代丟失細(xì)胞，但因細(xì)胞消化、機(jī)械損傷和微環(huán)境改變等，大量移植細(xì)胞會死亡，移植 DA 存活率低，移植后第一周對細(xì)胞存活很關(guān)鍵，抑制 p53、改變聚唾液酸表達(dá)或注射 GDNF 有助于提高細(xì)胞存活率。
• 雖神經(jīng)元細(xì)胞長距離遷移證據(jù)少，但需證明注射后細(xì)胞分布，非侵入性細(xì)胞追蹤方法可用于監(jiān)測動物，避免多個時間點(diǎn)處死動物。

4.5 體內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)

• 移植的神經(jīng)元細(xì)胞多由 NSC 和未成熟祖細(xì)胞組成，需在體內(nèi)進(jìn)一步分化成熟。體外分化技術(shù)可靠，但體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境會影響細(xì)胞命運(yùn)造成異質(zhì)性，單細(xì)胞 RNA 測序顯示移植的多巴胺能祖細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞類型，不同 NSC 系在脊髓產(chǎn)生神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例不同，因此確認(rèn)細(xì)胞產(chǎn)物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為所需細(xì)胞類型及是否存在危險細(xì)胞類型很重要。

4.6 細(xì)胞功效評估

• 動物模型療效評估是臨床試驗(yàn)的先決條件，理想動物模型應(yīng)再現(xiàn)患者病理病變和行為癥狀。小鼠和大鼠模型因易獲取和成本低常用于療效測試，非人靈長類動物模型在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中更具優(yōu)勢，更能準(zhǔn)確預(yù)測人類細(xì)胞劑量效應(yīng)和療效。
• 應(yīng)開發(fā)和使用有效的行為評估方法和標(biāo)準(zhǔn)證明細(xì)胞產(chǎn)品功效，功能終點(diǎn)包括細(xì)胞支配、神經(jīng)回路重建等方面研究，有助于理解作用機(jī)制，鼓勵研究人員發(fā)表臨床前結(jié)果以進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證，多項(xiàng)使用 hPSC 衍生神經(jīng)元細(xì)胞的臨床研究正在進(jìn)行。

5. 挑戰(zhàn)與未來前景

5.1 即用型冷凍保存格式

• 細(xì)胞冷凍保存的發(fā)展為細(xì)胞替代療法創(chuàng)造了條件，但有效細(xì)胞產(chǎn)品面臨配方開發(fā)難題。當(dāng)前多數(shù)冷凍產(chǎn)品輸注前需解凍后清洗、濃縮以去除 DMSO 等賦形劑，這一額外處理增加安全風(fēng)險，還可能損害細(xì)胞穩(wěn)定性。
• 未來配方開發(fā)的主要方向是研發(fā)含更少賦形劑、更簡單（甚至不含 DMSO）的冷凍保存溶液，實(shí)現(xiàn)無需額外操作或僅簡單稀釋的即用型神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)品。甘油等其他冷凍保護(hù)劑可作為替代選擇，且地松鼠 iPSC 衍生神經(jīng)元獨(dú)特的抗寒途徑，為促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞臨床應(yīng)用帶來潛力。

5.2 功能檢測的替代標(biāo)記

• 預(yù)測神經(jīng)成熟和體內(nèi)結(jié)果是細(xì)胞置換面臨的挑戰(zhàn)。移植神經(jīng)元細(xì)胞成熟與整合耗時數(shù)月，功能評估需大量時間和動物。
• 鑒定替代標(biāo)志物能顯著提升細(xì)胞質(zhì)量和研究效率，為產(chǎn)品效力測定及放行測試提供基礎(chǔ)。Parmar 團(tuán)隊(duì)通過 RNA-Seq 明確多巴胺能祖細(xì)胞基因表達(dá)與體內(nèi)結(jié)果的關(guān)系，確定了相關(guān)標(biāo)志物，推動了該領(lǐng)域進(jìn)展。后續(xù)有望發(fā)現(xiàn)更多此類生物標(biāo)志物，但需投入驗(yàn)證工作。

5.3 低免疫原性細(xì)胞產(chǎn)品

• 免疫排斥是細(xì)胞替代療法的關(guān)鍵問題，多數(shù)試驗(yàn)采用同種異體細(xì)胞產(chǎn)品，而神經(jīng)元細(xì)胞替代療法需植入細(xì)胞長期存活。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)有免疫特權(quán)，但同種異體細(xì)胞在大腦中的免疫排斥仍存在。
• 傳統(tǒng)克服方法是使用免疫抑制藥物，但其有副作用，會增加感染和腫瘤形成風(fēng)險，對老年患者（退行性疾病治療的關(guān)鍵人群）威脅更大。
• 生成通用相容細(xì)胞是可行途徑。一是通過基因編輯使 hPSC 的 HLA 沉默，該策略已在體外和體內(nèi)證實(shí)可靠，但此類工程通用神經(jīng)元細(xì)胞的應(yīng)用尚未見報(bào)道；二是收集含多種 HLA 類型或單倍型的 hPSC 系，已在非人類靈長類動物中驗(yàn)證并在臨床研究中嘗試。不過這兩種方法各有利弊，臨床應(yīng)用前需獲取細(xì)胞安全性和低免疫原性的有力證據(jù)。

總結(jié)來說，hPSC衍生神經(jīng)細(xì)胞臨床研究雖進(jìn)展迅速，但面臨諸多挑戰(zhàn)，需深入研究以提升神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)品的安全性與有效性，尤其是關(guān)注潛在致瘤性和功能效力測定方面 。

參考資料：Sun Y, Feng L, Liang L, Stacey GN, Wang C, Wang Y, Hu B. Neuronal cell-based medicines from pluripotent stem cells: Development, production, and preclinical assessment. Stem Cells Transl Med. 2021 Nov;10 Suppl 2(Suppl 2):S31-S40. doi: 10.1002/sctm.20-0522. PMID: 34724724; PMCID: PMC8560198.

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